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概念：

凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱(chēng)之為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞離體時(shí)間短且不經(jīng)過(guò)永生化過(guò)程，其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保持原有的遺傳特征，可更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù)，很適合用于藥物測(cè)試、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究。

原理介紹：

原代細(xì)胞的分離是將人/小鼠等特異模式動(dòng)物的細(xì)胞從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖的過(guò)程。 原代培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以?xún)?nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng) 。

實(shí)驗(yàn)方法：

一、懸浮細(xì)胞的分離方法

組織材料若來(lái)自血液、 羊水、胸水或腹水的懸液材料， 最簡(jiǎn)單的方法是采用 1000r/min 的低速離心 10 分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(zhǎng)，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無(wú)鈣、鎂 PBS 洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因?yàn)?，?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。

二、實(shí)體組織材料的分離方法

對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

三、小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)

1、取肝臟：將小鼠斷頸致死，取肝臟；

2、除雜物：剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物；

3、研磨肝臟：用手術(shù)剪將臟器剪成小塊并研磨；

4、胰酶消化：加入胰酶消化，使細(xì)胞分離；

5、濾網(wǎng)去雜：用濾網(wǎng)過(guò)濾，除去大組織塊；

6、細(xì)胞計(jì)數(shù)：血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

原代培養(yǎng)注意事項(xiàng)：

（1）原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選取繁殖能力較強(qiáng)的組織，如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。

（2）樣本必須為無(wú)菌采取完整的組織塊，新鮮組織離體后置于無(wú)菌培養(yǎng)基中，冰袋運(yùn)輸。離體時(shí)間不可超過(guò)4小時(shí)。

（3）整個(gè)取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇時(shí)間1min左右，不能過(guò)長(zhǎng)，以確保胚胎細(xì)胞活性。

（4）運(yùn)用消化法時(shí)胰酶溫度應(yīng)低于37℃，濃度只需平時(shí)消化細(xì)胞濃度的一半。因?yàn)榇诉^(guò)程不像消化培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的1~10min，而是至少20min，先消化下來(lái)的細(xì)胞在此胰酶消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以胰酶不能作用過(guò)強(qiáng)，否則這些細(xì)胞易被損傷而不易生存。

（5）如使用組織塊法，則應(yīng)待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時(shí)再使之與培養(yǎng)液接觸，匆使組織塊漂浮起來(lái)。如果組織塊沒(méi)有黏壁，則細(xì)胞不易生長(zhǎng)，即使生長(zhǎng)也因沒(méi)有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無(wú)法收集到生長(zhǎng)的細(xì)胞。

（6）原代培養(yǎng)操作時(shí)，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。

（7）本實(shí)驗(yàn)也可以使用新生乳鼠做培養(yǎng)材料。此時(shí)要將乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮膚充分消毒，由于乳鼠原代培養(yǎng)污染概率更高，故應(yīng)小心操作，避免污染細(xì)菌。乳鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞的存活率不及胚胎細(xì)胞培養(yǎng)的成功率。

案例展示：