久久精品无码鲁网中文,国产色无码精品视频国产,国产在线一区二区视频,亚洲综合色区另类小说

一、TUNEL檢測(cè)：

TUNEL染色是檢測(cè)細(xì)胞凋亡染色的常見(jiàn)方法，其原理是細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素、生物素標(biāo)記的dUTP，從而可以通過(guò)熒光顯微鏡或化學(xué)顯色方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。

二、樣本準(zhǔn)備

根據(jù)樣本選擇相應(yīng)樣本處理，動(dòng)物組織需包埋選擇1，動(dòng)物組織需冰凍選擇2，細(xì)胞爬片樣本選擇3，細(xì)胞涂片樣本選擇4。

1、 石蠟包埋組織切片

① 將組織切片放入二甲苯中浸泡5min，重復(fù)1次，以徹底脫掉石蠟。

②  100%乙醇浸泡5min，重復(fù)1次。

③ 梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3min。

④ PBS輕輕潤(rùn)洗，濾紙小心吸干多余液體。用石蠟筆或疏水筆在周圍描繪樣品分布輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。

⑤ 配制Proteinase K工作液：PBS稀釋2mg/mL的Proteinase K溶液（1:100），終濃度為20μg/mL。

⑥ 滴100μL上述Proteinase K工作液，使其全部覆蓋，孵育20min。

⑦ PBS潤(rùn)洗樣本，并用濾紙小心吸樣本周圍液體。處理后放于濕盒保存。

2、組織冰凍切片

① 玻片浸沒(méi)于4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，孵育15min。

② 用濾紙小心吸干周圍多余液體。

③ 將玻片浸沒(méi)于PBS溶液，孵育15min。

④ 用濾紙小心吸干周圍多余液體。用石蠟筆或疏水筆在周圍描繪樣品分布輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。

⑤ 配制Proteinase K工作液：PBS稀釋2mg/mL的Proteinase K溶液（1:100），終濃度為20μg/mL。

⑥ 滴加100μL上述Proteinase K工作液，使其被全部覆蓋，室溫孵育10min。

⑦ 用PBS溶液潤(rùn)洗樣本3次。

⑧ PBS潤(rùn)洗樣本，并用濾紙小心吸樣本周圍液體。處理后放于濕盒保存。

3、細(xì)胞爬片的準(zhǔn)備

在Lab-Tek載玻片小室（Chamber Slides）上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。在凋亡誘導(dǎo)處理之后，用PBS洗2遍載玻片。

4、 細(xì)胞涂片的制備

① 準(zhǔn)備多聚賴氨酸包被的載玻片：100 μL 0.01% (w/v)多聚賴氨酸水溶液滴至載玻片表面，涂散為一薄層，晾干。去離子水漂洗，晾干30-60 min。

② 以約2×10⁷個(gè)細(xì)胞/mL的濃度將細(xì)胞重懸于PBS中，吸取100μL細(xì)胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上，用一片干凈載玻片輕柔涂開細(xì)胞懸液。

③ 固定細(xì)胞，將載玻片浸入含4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛染色缸中，4℃放置25min。

④ 洗滌載玻片，將其浸入PBS中，室溫放置5min。重復(fù)用PBS洗1次。

⑤ 用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。

⑥ 配制Proteinase K工作液：PBS稀釋2mg/mLProteinase K溶液（1:100），終濃度為20μg/mL。

⑦ 滴加100μL上述Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育5min（或浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液，孵育5min進(jìn)行通透處理）。

⑧ 在盛有PBS溶液敞口燒杯中浸沒(méi)清洗樣本2次。

⑨ 用濾紙小心吸樣本周圍液體。處理后放于濕盒保存。

三、實(shí)驗(yàn)流程

① 按1:5的比例用去離子水稀釋5×Equilibration Buffer。

② 樣本滴加100μL 1×Equilibration Buffer，使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，室溫孵育10-30min。或?qū)⑤d玻片放入1個(gè)含1×Equilibration Buffer的缸中，保證緩沖液沒(méi)過(guò)樣本。平衡細(xì)胞的同時(shí)在冰上解凍FITC-12-dUTP Labling Mix，并依下表，準(zhǔn)備足夠量的用于所有實(shí)驗(yàn)和可選陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。

表 準(zhǔn)備用于實(shí)驗(yàn)的和可選陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液

陰性對(duì)照體系：準(zhǔn)備1份不含TdT酶的對(duì)照孵育緩沖液，用ddH₂O替代TdT酶。

③ 平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙洗掉100μL 1×Equilibration Buffer中的大部分，在5cm²面積細(xì)胞上加入50μLTdT孵育緩沖液。之后操作用鋁箔紙包裹避光處理。

④ 塑料蓋玻片蓋在細(xì)胞上以保證試劑的平均分布。濕盒底部放上用水浸濕的紙巾，將載玻片置于濕盒內(nèi)，37℃孵育60min。

⑤ 移除塑料蓋玻片，將切片置于PBS溶液孵育5min。

⑥ 輕輕去掉多余液體，換用新鮮PBS溶液孵育5 min，重復(fù)1次。

⑦ 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。

⑧ 樣本在染色缸染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液（1μg/mL，用PBS新鮮配制并稀釋）的染色缸，放置5min。

⑨ 洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水，放置5min，重復(fù)2次，總共洗3次。

⑩ 叩干載玻片上多余水且用吸水紙擦拭細(xì)胞周邊區(qū)域。

? 立即在熒光顯微鏡下分析樣本，用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過(guò)濾裝置在520±20nm的熒光下觀察綠色熒光；在＞620nm下觀察PI的紅色熒光，或在460nm觀察藍(lán)色的DAPI。如有必要，載玻片能在4℃黑暗條件下存放過(guò)夜。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。

四、樣本要求及運(yùn)輸條件：

1、提供固定完全的組織樣本。組織離體后，選擇合適的固定液和容器立即固定，固定液的量建議大于組織體積的10-15倍，固定時(shí)間建議24-48h，大標(biāo)本固定12h，再切開固定。固定完全后盡快送檢。標(biāo)本常溫（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷凍結(jié)冰，固定樣本常溫運(yùn)輸送樣。

2、提供編號(hào)清晰的蠟塊或蠟頭。

3、石蠟切片常溫運(yùn)輸，冰凍切片-80℃保存干冰運(yùn)輸。

4、爬片必須充分固定，常溫運(yùn)輸。

五、注意事項(xiàng)：

1、任何實(shí)驗(yàn)方法都存在局限性，根據(jù)TUNEL實(shí)驗(yàn)的本質(zhì)問(wèn)題，公司不能保證結(jié)果中凋亡細(xì)胞的多少（即假陽(yáng)性、或偏陰性結(jié)果）。

2、TUNEL染色建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)（預(yù)實(shí)驗(yàn)由客戶提供預(yù)期高表達(dá)的樣本，蠟塊或切片皆可），確認(rèn)效果后，再做正式實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)先由客戶自行確認(rèn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)間隔周期不要太久，建議連續(xù)三周內(nèi)完成。

3、正式實(shí)驗(yàn)的趨勢(shì)我司不做保證。

六、實(shí)驗(yàn)圖：