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透射電鏡概念：透射電鏡（Transmission Electron Microscope，TEM），全稱透射電子顯微鏡，是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到超薄切片的樣品上（通常70-90nm），電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像，影像將在放大、聚焦后在成像器件上顯示出來。是一種高分辨率（0.1nm-0.2nm）、高放大倍數(shù)（0.2K-600K）的顯微鏡。能夠清楚的觀察到在普通光學(xué)顯微鏡下無法看清的動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，比如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、自噬小體、凋亡小體、葉綠體、液泡、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌或病毒侵染等結(jié)構(gòu)及病理變化。透射電鏡超薄切片除了能夠顯示細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)之外，還可用于觀察病原微生物，如各類細(xì)菌真菌等。

主要用途：透射電鏡在細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、病毒學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)、材料科學(xué)等諸多領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用?？梢杂^測(cè)動(dòng)物植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、葉綠體、液泡、細(xì)胞內(nèi)生細(xì)菌等結(jié)構(gòu)及病理變化。可以觀測(cè)病毒顆粒、外泌體、病原微生物、各類細(xì)菌真菌、納米材料及納米顆粒、晶體結(jié)構(gòu)。

掃描電鏡概念：掃描電鏡（?SEM）?是一種利用電子束掃描樣品表面并收集樣品發(fā)出的物理信號(hào)來獲取表面形貌信息的顯微技術(shù)。掃描電鏡的高分辨率和深度信息使其成為一種重要的研究工具，?能夠提供關(guān)于樣品表面的詳細(xì)信息，?對(duì)于理解和分析材料的性質(zhì)、?生物樣本的微觀結(jié)構(gòu)以及地質(zhì)樣本的礦物組成等方面具有不可替代的作用。

主要用途：

1、三維形貌的觀察和分析。

2、觀察形貌的同時(shí)，進(jìn)行微區(qū)的成分分析。

             透射電鏡取材注意事項(xiàng)

樣品的取材與固定是生物電鏡技術(shù)中最關(guān)鍵的一步，樣品的質(zhì)量直接決定了電鏡數(shù)據(jù)的質(zhì)量。取材導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)差，后期實(shí)驗(yàn)中無法補(bǔ)救。對(duì)取材的基本要求是：確保樣品盡可能接近自然生活狀態(tài)，同時(shí)確保位置準(zhǔn)確。不同的樣品，取材細(xì)節(jié)上有較大區(qū)別，有任何疑問，歡迎咨詢聯(lián)系相關(guān)技術(shù)人員！

需要的器材：2.5%電鏡專用戊二醛、PBS或生理鹽水、鋒利的手術(shù)刀、鑷子、牙簽、吸管、封口膜、細(xì)胞刮、離心機(jī)、切割板（光盤或塑料盤）、0℃碎冰（不要冰袋）、1.5ml尖頭ep管、鉛筆、記號(hào)筆。

一、動(dòng)物組織取材流程及要求

取材流程：（1-3min之內(nèi)取材完畢）

1、試劑、容器、器械4℃預(yù)冷，取材冰上操作（0℃碎冰，不要凍存的冰袋，無條件可室溫）。提前滴一些2.5%戊二醛在切割板上；

2、動(dòng)物麻醉/處死，快速打開需要取材的位置。趁血液還在流動(dòng)時(shí)，迅速切取一塊組織，生理鹽水或PBS快速?zèng)_洗后浸泡到切割板上的戊二醛中進(jìn)一步切割；

有方向性的樣品：如肌絲、脊髓、腸道、血管等，沿著組織伸展方向切成1mm*1mm*3mm的長(zhǎng)條，以便分辨方向。

薄片狀樣品：如視網(wǎng)膜、粘膜等可以切的大一些3mm*3mm左右。

無方向性的樣品：選擇位置準(zhǔn)確的部位切成1mm3小塊，切記寧缺毋濫，保證取的每一塊都是準(zhǔn)確的。如：觀察腎小球取腎皮質(zhì)，觀察肺泡避開氣管取肺葉。

有被膜的樣品：去除被膜或者將被膜破孔方便滲透。樣品大小盡量接近，不規(guī)則或稍大一點(diǎn)沒關(guān)系。一定要避免修整樣品時(shí)造成邊緣組織機(jī)械損傷，這樣反而效果不好。

3、切的時(shí)候避免刀片對(duì)樣品的擠壓，應(yīng)該拉刀法（斜著前后拉動(dòng)手術(shù)刀）切斷，切樣時(shí)，配合牙簽輕輕撥動(dòng)樣品，將樣品切成符合要求的形狀。疏松多孔及柔軟的樣品可以大一些，避免樣品溶解或壓壞。最后將樣品用沾水的牙簽粘入1.5ml尖頭EP管。不要用鑷子夾樣品。加滿2.5%戊二醛。4℃避光保存。如果樣品漂浮，可用紙或紗布將組織壓到液面以下。

4、取好的樣品封口膜封口，氣泡膜包裹厚一點(diǎn)再郵寄。樣品不要和冰袋直接接觸，防凍傷。

注意事項(xiàng)：

1、組間位置一致。同一器官不同部位的同種細(xì)胞，結(jié)構(gòu)也有較大差異；

2、器具鋒利，柔軟的組織要用手術(shù)刀輕輕拉斷，盡量避免壓斷，保證切面鋒利。

3、冰上操作時(shí)，用制冰機(jī)的碎冰，如果沒有碎冰，可以室溫取材，冰袋易凍傷樣品。

4、取材速度，條件是靈活的，把握整體原理，不要刻意為了保證位置或大小，切壞了樣品。尤其是要避免樣品擠壓以及冰袋凍壞樣品。

關(guān)于灌注取材：

灌注取材要求較高，盡量不要灌注。因?yàn)楣嘧⒉怀浞?，反而?huì)導(dǎo)致超微結(jié)構(gòu)較差。較大且較深，不好定位的組織，可以選擇灌注。要求如下：

1、灌注液建議：終濃度為4%多聚甲醛+1%戊二醛混合液，稀釋液為PB（配方參考附件）；

2、多聚甲醛和戊二醛均為電鏡專用，多聚甲醛建議新鮮配置7天以內(nèi)的；                        

3、灌注方式以機(jī)械泵輔助灌注，盡量灌注充分。灌注不充分會(huì)導(dǎo)致部分區(qū)域結(jié)構(gòu)差。                        

4、灌注完成之后，按上述要求電鏡取材，樣品固定在2.5%戊二醛中，4度郵寄給我們。較大且較深的組織，振動(dòng)切片成150-200um的厚片固定，方便后續(xù)操作。

二、細(xì)胞細(xì)菌取材流程及要求

貼壁細(xì)胞取材流程：細(xì)胞取材有2種方法，分別為刮取法和消化法。均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，請(qǐng)根據(jù)情況酌情取材。

刮取法操作流程：

1、請(qǐng)用6cm-10cm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，方便后續(xù)操作；

2、細(xì)胞倒掉培養(yǎng)液，加入恢復(fù)至室溫的戊二醛固定液2ml。

3、細(xì)胞常溫避光固定5min后，用細(xì)胞刮刀斜45°朝一個(gè)方向快速鏟下，保持一個(gè)方向，不要來回刮；

1、得到的細(xì)胞懸液吸入離心管，離心（1500-3000rpm）3-5min，棄上清，然后加入新的電鏡固定液。再次更換固定液后，室溫避光固定30min后，4℃保存。細(xì)胞團(tuán)塊需要有綠豆大小，如圖所示。太大的團(tuán)塊建議吹散重懸。

5、取好的樣品封口膜封口，氣泡膜包裹厚一點(diǎn)再郵寄。樣品不要和冰袋直接接觸，防凍傷。

消化法特點(diǎn)操作流程：

1、培養(yǎng)好的細(xì)胞（細(xì)胞密度不超過70%）棄培養(yǎng)基，加入胰酶消化。

2、胰酶消化好后（時(shí)間不宜過長(zhǎng)），加培養(yǎng)基終止消化，吸管輕輕吹打至細(xì)胞起浮。吸入離心管，低速離心（1500-3000rpm），3-5min左右，細(xì)胞團(tuán)要有綠豆大小，如圖所示。

3、棄上清，加入電鏡固定液（室溫），細(xì)胞量多需要吹散，少量細(xì)胞無需吹散。

4、室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4°保存運(yùn)輸。

5、取好的樣品封口膜封口，氣泡膜包裹厚一點(diǎn)再郵寄。樣品不要和冰袋直接接觸，防凍傷。

懸浮細(xì)胞取材流程：

細(xì)胞懸液離心（1500-3000rpm）3-5min，棄掉培養(yǎng)基后加入2.5%戊二醛室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)入4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸。細(xì)胞團(tuán)塊需要有綠豆大小，如圖所示。太大的團(tuán)塊可用牙簽挑成幾塊。取好的樣品封口膜封口，氣泡膜包裹厚一點(diǎn)再郵寄。樣品不要和冰袋直接接觸，防凍傷。

細(xì)菌取材流程：

1、固定培養(yǎng)的細(xì)菌：牙簽挑取菌落置于室溫2.5%戊二醛，避光固定30min。再轉(zhuǎn)入4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸。樣品包裹厚一點(diǎn)，不要和冰袋直接接觸，以免凍傷。細(xì)胞團(tuán)塊需要有綠豆大小，如圖所示。太大的團(tuán)塊可用牙簽挑成幾塊。

2、懸浮細(xì)菌：細(xì)菌懸液離心（5000-10000rpm）3-5min，棄掉培養(yǎng)基后加入2.5%戊二醛室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)入4℃保存。細(xì)胞團(tuán)塊需要有綠豆大小，如圖所示。4℃冰袋運(yùn)輸。取好的樣品封口膜封口，氣泡膜包裹厚一點(diǎn)再郵寄。樣品不要和冰袋直接接觸，防凍傷。

注意事項(xiàng)：

1、不要反復(fù)來回刮細(xì)胞，會(huì)造成細(xì)胞大量損傷；

2、離心的目的是讓細(xì)胞聚集成團(tuán)，轉(zhuǎn)速不可太高，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞變形；

3、樣品保存郵寄時(shí)，避免凍傷。

三、外泌體、噬菌體、病毒、脂質(zhì)體等：

1、建議提供濃縮液至少50ul，樣品的純度及濃度盡量高。

2、保存及運(yùn)輸方式以樣品結(jié)構(gòu)性狀穩(wěn)定為要點(diǎn)。如：凍存的外泌體及病毒，不好反復(fù)凍融，所以建議干冰郵寄。新鮮提取的外泌體及噬菌體等，4℃可存放3-5天，所以樣品可冰袋郵寄。部分樣品可能在常溫更能穩(wěn)定保存其形態(tài)，即可常溫郵寄。

3、取好的樣品封口膜封口，氣泡膜包裹厚一點(diǎn)再郵寄。

四、植物組織取材及要求

取材流程：

1、PBS沖洗樣品表面，去除泥沙等污染物。

2、用鋒利的手術(shù)刀或剪刀切割樣品，切樣時(shí)，可配合牙簽輕輕撥動(dòng)樣品，將樣品切成符合要求的形狀，有方向的樣品：如根尖、莖等，沿著組織伸展方向切成1mm*1mm*3mm的長(zhǎng)條，以便分辨方向。薄片狀樣品可以切的大一些3mm*3mm左右。沒有方向的樣品切成1mm3小塊，切記寧缺毋濫，保證取的每一塊都是準(zhǔn)確的，如觀察果皮就要去除果肉。觀察果肉就要去除果皮。觀察葉片就需要避開葉脈。有膜殼的樣品要去除膜殼或者將膜殼破孔方便滲透；

2、注意切割邊緣整齊，去除機(jī)械損傷的位置。

3、最后將樣品用沾水的牙簽沾入1.5ml尖頭EP管。加滿2.5%戊二醛。4℃避光保存。不要用鑷子夾樣品。如果樣品漂浮，可用紙或紗布將組織壓到液面以下。如果需要抽氣，注意抽氣的程度，太強(qiáng)烈可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化。

4、取好的樣品封口膜封口，氣泡膜包裹厚一點(diǎn)再郵寄。樣品不要和冰袋直接接觸，防凍傷。

注意事項(xiàng)：

1、組間位置一致。同一器官不同部位的同種細(xì)胞，結(jié)構(gòu)也有較大差異；

2、樣品大小盡量接近，不規(guī)則或稍大一點(diǎn)沒關(guān)系。

3、器具鋒利，柔軟的組織要用手術(shù)刀輕輕拉斷，盡量避免壓斷，保證切面鋒利。一定要避免修整樣品時(shí)造成邊緣組織機(jī)械損傷，這樣反而效果不好。

4、冰上操作時(shí)，用制冰機(jī)的碎冰，如果沒有碎冰，可以室溫取材，冰袋易凍傷樣品。

5、取材速度，條件是靈活的，把握整體原理，不要刻意為了保證位置或大小，切壞了樣品。尤其是樣品擠壓以及冰袋凍壞樣品。

五、樣本儲(chǔ)存運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)

儲(chǔ)存：樣本取材后，4℃避光保存時(shí)間最好不超過1個(gè)月。

運(yùn)輸：固定液充滿EP管，封口膜封口。如下圖，氣泡膜或報(bào)紙包裹7-8層。紙質(zhì)送樣單+泡沫盒+冰袋的方式運(yùn)輸，冰袋2-3個(gè)（-20℃冰袋，不要太多，夏季3-4個(gè)），順豐寄付。

附件：戊二醛配方

1、0.2M 磷酸緩沖液配方：

A液：0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液：

NaH2PO4.H2O27.6g 或 NaH2PO4.2H2O 31.21g加雙蒸水到1000ml

B液：0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液：

Na2HPO4.2H2O 35.61g 或 Na2HPO4.12H2O 71.64g加雙蒸水到1000ml

A液23ml+B液77ml混合得到0.2M磷酸緩沖液。

2、2.5﹪戊二醛固定液配方：

0.2M磷酸緩沖液50ml+25﹪戊二醛（電鏡專用）10ml+雙蒸水，定容至100ml

調(diào)整pH 值 7.3-7.4

六、結(jié)果示例：

掃描電鏡取材注意事項(xiàng)

一、細(xì)胞爬片、蓋玻片等培養(yǎng)的細(xì)胞樣品：

推薦用六孔板或培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞爬片樣品，棄掉培養(yǎng)基， PBS 快速洗 2 遍， 棄掉 PBS，加入2.5%電鏡專用戊二醛固定液固定。固定液可以多加一些， 樣品需要完全浸沒在固定液里， 4 ℃固定 12h 以上。加滿2.5%戊二醛固定液， 樣品封口膜封口， 氣泡膜包裹， 然后泡沫盒+ 冰袋快遞運(yùn)輸。

二、固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌樣品：

已經(jīng)長(zhǎng)成菌落的細(xì)菌樣品，直接用棉簽或者牙簽挑起米粒大小菌落，轉(zhuǎn)入 2.5%戊二醛固定液中， 1.5ml的ep 管，固定液加滿，4 ℃固定 12h 以上。泡沫盒+冰袋快遞運(yùn)輸。

三、懸浮細(xì)胞、菌液、藻液等樣品：

樣品離心， 棄上清， PBS 洗 2 次，棄 PBS，加入 2.5%戊二醛固定液，轉(zhuǎn)入1.5m的ep 管， 加滿2.5%戊二醛固定液，樣品封口膜封口， 氣泡膜包裹， 4 ℃固定 12h 以上，泡沫盒+冰袋快 遞運(yùn)輸。對(duì)于細(xì)菌樣品， 如果需要觀測(cè)鞭毛， 請(qǐng)盡量讓細(xì)菌自然沉淀， 去除上清時(shí)盡量操作輕柔，離心會(huì)使鞭毛脫落。

四、動(dòng)植物植物組織樣品：

動(dòng)物組織： 動(dòng)物麻醉， 處死，快速切取需要觀察的組織部位， 生理鹽水沖洗血液，用鋒利的剪刀或手術(shù)刀暴露出需要觀察的面。管狀組織切成0.5cm長(zhǎng)度的小段，其他無方向性的組織切成0.5cm*0.5cm*0.5cm左右的小塊。請(qǐng)注意切取的小塊必須包含待測(cè)結(jié)構(gòu)且方便辨認(rèn)，   特別是對(duì)于有方向性的樣品，注意區(qū)分方向。取材后于2.5%戊二醛4℃固定保存12h以上， 郵寄時(shí)固定液加滿， 樣品封口膜封口，氣泡膜包裹，泡沫盒+冰袋快遞運(yùn)輸。

植物組織： 植物樣品用PBS或者蒸餾水沖洗，去除表面環(huán)境雜質(zhì)，然后用鋒利的手術(shù)刀或剪刀切取需要觀察的部位， 葉片切成： 0.5cm*0.5cm大小，根切取0.5cm左右長(zhǎng)度的小段。其他果實(shí)或組織0.5cm*0.5cm*0.5cm左右。請(qǐng)注意切取的小塊必須包含待測(cè)結(jié)構(gòu)且方便辨認(rèn)， 特別是對(duì)于有方向性的樣品，注意區(qū)分方向。取材后于2.5%戊二醛4℃保存，如果樣品漂浮，  需要用真空泵反復(fù)抽沉， 或者用棉花或紗布將樣品壓到液面以下。 4℃保存12h以上。對(duì)于郵寄時(shí)固定液加滿， 樣品封口膜封口，氣泡膜包裹，泡沫盒+冰袋快遞運(yùn)輸。

五、干燥樣品：

對(duì)于干燥的種子、材料等樣品， 可直接郵寄， 無需固定。

樣品保存及郵寄：

1、儲(chǔ)存：樣本取材后，4℃保存時(shí)間盡量不超過1個(gè)月。

2、運(yùn)輸：固定液充滿EP管，封口膜封口，氣泡膜或報(bào)紙包裹厚一些。最后泡沫盒+冰袋的方式運(yùn)輸， 冰袋2-3個(gè)(-20℃冰袋，不要太多) ，一定要與樣品隔開。特殊樣品如脂肪、 植物等，用紗布將樣品壓到液面以下，保證充分固定。

掃描電鏡結(jié)果示例：