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概念：

免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence technique）是在免疫學(xué)、生物化學(xué)與顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱為熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法，稱為熒光抗原法。這兩種方法總稱為免疫熒光技術(shù)。但實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)應(yīng)用很少，所以常將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)。

熒光單標(biāo)：

在一張切片上對(duì)一個(gè)抗原進(jìn)行標(biāo)記，即為免疫熒光IF單標(biāo)，可直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上原位顯示某些蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，通?？蓸?biāo)記紅光或綠光，細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記。

熒光雙標(biāo)：

在一張切片上對(duì)兩個(gè)抗原進(jìn)行標(biāo)記，即為免疫熒光IF雙標(biāo)，可直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上原位顯示某些蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，普通方法免疫熒光雙標(biāo)要求一抗來源不能相同，若是相同，二抗無法區(qū)分。不同的一抗對(duì)應(yīng)標(biāo)記不同顏色，可以用于定位兩種不同的抗原。

熒光三標(biāo)：

在一張切片上對(duì)三個(gè)抗原進(jìn)行標(biāo)記，即為免疫熒光IF三標(biāo)，可直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上原位顯示某些蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，普通方法免疫熒光三標(biāo)要求一抗來源不能相同，若是相同，二抗無法區(qū)分。不同的一抗對(duì)應(yīng)標(biāo)記不同顏色，可以用于定位三種不同的抗原。

主要用途：

免疫熒光染色及成像分析是研究組織形態(tài)和組織原位抗原表達(dá)不可或缺的檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于臨床病理和醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。凡是可以作為抗原或半抗原的物質(zhì)，如：蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、酶、激素、病原體及受體等，都可以在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)到。

檢測(cè)原理：

免疫熒光技術(shù)根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體（或抗原）標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再利用這種熒光抗體（或抗原）作為探針來檢測(cè)固定細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在熒光顯微鏡下觀察，當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光照射后，會(huì)發(fā)射出一定波長的熒光，從而確定靶抗原（或抗體）的性質(zhì)與定位，還可利用定量技術(shù)（如：流式細(xì)胞儀）測(cè)定含量。

實(shí)驗(yàn)流程：

脫蠟與水化-抗原修復(fù)-血清封閉-孵育一抗-孵育二抗-DAPI染核-封片-顯微鏡鏡檢。

樣本要求及運(yùn)輸條件：

1、提供固定合格的樣本。組織離體后，選擇合適的固定液立即固定，固定液的量建議大于組織體積的10-15倍，新鮮標(biāo)本用合適的容器固定24-48h，大標(biāo)本固定12h，再切開固定。標(biāo)本常溫（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷凍結(jié)冰，固定樣本常溫運(yùn)輸送樣。

2、涂片和爬片必須充分固定，石蠟切片實(shí)驗(yàn)前需充分脫蠟。

3、提供準(zhǔn)確的抗體信息。

結(jié)果示例：

實(shí)驗(yàn)常見問題解答：

1、為什么背景染色較深？

1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色。

2）抗體孵育時(shí)間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，更好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長：DAB更好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色更好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過長。

4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4oC冰箱過夜，對(duì)結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長。

6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要么不顯色要么背景著色。用新買抗體時(shí)更好設(shè)立陽性對(duì)照和用使用過的抗體作比較。

2、為什么定位不準(zhǔn)確？

1）細(xì)胞核干擾：細(xì)胞核位置前面的細(xì)胞質(zhì)染色干擾造成，可以降低抗體濃度，孵育時(shí)間

2）細(xì)胞或者組織狀態(tài)不對(duì)：細(xì)胞或者組織狀態(tài)不同導(dǎo)致你的目的蛋白細(xì)胞定位不同，造成最后的定位不對(duì)，如果一直出現(xiàn)定位不對(duì)問題，建議重新培養(yǎng)細(xì)胞調(diào)整好狀態(tài)或者重新取材，進(jìn)行再次染色。

3）共定位問題解析：假設(shè)想證明某一細(xì)胞發(fā)生某種變化，換句話說就是既有某種蛋白表達(dá)，又有另一種蛋白表達(dá)，兩種蛋白屬于共定位，該種情況可以采用免疫雙標(biāo)記檢測(cè)；如果兩種蛋白不屬于共定位，假設(shè)一種在膜上表達(dá)，一種在胞漿表達(dá)，該種情況應(yīng)該不屬于共定位，屬于共表達(dá)，這時(shí)候?qū)嶒?yàn)應(yīng)該重新設(shè)計(jì)去驗(yàn)證你的結(jié)論。

4）核定位不對(duì)：核內(nèi)表達(dá)的抗原定位用免疫熒光或者免疫酶標(biāo)都可以。如果定位不正確，建議封閉和打孔合為一步，即在封閉液中添加0.5% TRITON-100，37度封閉2小時(shí)，加一抗后最好4度孵育過夜（16小時(shí)）。