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一、ELISA實(shí)驗(yàn)介紹

 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定enzyme linked immunosorbent assay（簡(jiǎn)寫ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理

ELISA目的是檢測(cè)血清、尿液、細(xì)胞上清等液體中特定的抗原，以達(dá)到定性判斷的目的。

ELISA原理即將已知的抗原或者抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。示意圖如下：

三、實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1.將酶標(biāo)板取出，分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)依次各設(shè)兩孔，每孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測(cè)樣本孔中加入待測(cè)樣本10μL，再加入樣本稀釋液40μL（樣本稀釋5倍）。（加樣順序及相應(yīng)編號(hào)見excel表中相關(guān)內(nèi)容?。?/span>

2.棄去液體，將洗液工作液按350μL/每孔注入孔內(nèi)，靜置10s甩干，重復(fù)洗板5次，在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。

3.每孔中加入檢測(cè)抗體50μL（在使用前10分鐘內(nèi)配制），充分混勻，貼上不干膠封面，37℃溫育30分鐘。

4.重復(fù)步驟2。

5.每孔加顯色劑A 50μL，顯色劑B 50μL，振蕩混勻后，37℃避光顯色10分鐘，每孔加終止液50μL。

6.用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在反應(yīng)終止后10分鐘內(nèi)檢測(cè)。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測(cè)程序。

7.實(shí)驗(yàn)完畢后，未使用完的試劑按規(guī)定保存溫度放回冰箱保存。

四、數(shù)據(jù)展示

五、送樣運(yùn)輸要求

1、動(dòng)植物組織樣本(干冰運(yùn)輸)

準(zhǔn)確稱取動(dòng)物組織重量按重量(MG):體積(UL)=1:9的比例加入9倍體積的勻漿介質(zhì)(推薦0.86%或0.9%的生理鹽水)，冰水浴條件下，機(jī)械勻漿，制備成10%的勻漿液，2500~3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，取上清液進(jìn)行測(cè)定。

2、血清樣本(干冰運(yùn)輸)

全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜(GLU檢測(cè)請(qǐng)勿全血樣本放置過夜取血清)后于2-8℃ 3000轉(zhuǎn)/分離心15MIN，取上清即可立即檢測(cè);或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣本應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。

3、血漿樣本(干冰運(yùn)輸)

可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃C3000轉(zhuǎn)/分離心15MIN，取上清即可立即檢測(cè);或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣本應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。

4、細(xì)胞樣本貼壁細(xì)胞

將細(xì)胞用PBS沖洗2次后，用細(xì)胞刮將細(xì)胞小心刮下來(lái)，將培養(yǎng)液3000轉(zhuǎn)/分，離心10MIN。棄上清留細(xì)胞沉淀，干冰運(yùn)輸。懸浮細(xì)胞:將培養(yǎng)液3000轉(zhuǎn)/分，離心10MIN。棄上清留細(xì)胞沉淀，干冰運(yùn)輸。

5、細(xì)胞上清:  標(biāo)本于2-8℃，3000轉(zhuǎn)/分離心15MIN取上清，上清立即用于實(shí)驗(yàn)或分裝后于-20℃或-80℃保存。避免反復(fù)凍融。