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一、ELISA實(shí)驗(yàn)介紹
酶聯(lián)免疫吸附測定enzyme linked immunosorbent assay(簡寫ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。
二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理
ELISA目的是檢測血清、尿液、細(xì)胞上清等液體中特定的抗原,以達(dá)到定性判斷的目的。
ELISA原理即將已知的抗原或者抗體吸附在固相載體表面,使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。示意圖如下:
三、實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫;試劑或樣品配制時(shí),均需充分混勻,并盡量避免起泡。
1.將酶標(biāo)板取出,分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)依次各設(shè)兩孔,每孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50μL;待測樣本孔中加入待測樣本10μL,再加入樣本稀釋液40μL(樣本稀釋5倍)。(加樣順序及相應(yīng)編號(hào)見excel表中相關(guān)內(nèi)容!)
2.棄去液體,將洗液工作液按350μL/每孔注入孔內(nèi),靜置10s甩干,重復(fù)洗板5次,在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
3.每孔中加入檢測抗體50μL(在使用前10分鐘內(nèi)配制),充分混勻,貼上不干膠封面,37℃溫育30分鐘。
4.重復(fù)步驟2。
5.每孔加顯色劑A 50μL,顯色劑B 50μL,振蕩混勻后,37℃避光顯色10分鐘,每孔加終止液50μL。
6.用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。在反應(yīng)終止后10分鐘內(nèi)檢測。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源,預(yù)熱儀器,設(shè)置好檢測程序。
7.實(shí)驗(yàn)完畢后,未使用完的試劑按規(guī)定保存溫度放回冰箱保存。
四、數(shù)據(jù)展示
五、送樣運(yùn)輸要求
1、動(dòng)植物組織樣本(干冰運(yùn)輸)
準(zhǔn)確稱取動(dòng)物組織重量按重量(MG):體積(UL)=1:9的比例加入9倍體積的勻漿介質(zhì)(推薦0.86%或0.9%的生理鹽水),冰水浴條件下,機(jī)械勻漿,制備成10%的勻漿液,2500~3000轉(zhuǎn)/分鐘,離心10分鐘,取上清液進(jìn)行測定。
2、血清樣本(干冰運(yùn)輸)
全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜(GLU檢測請(qǐng)勿全血樣本放置過夜取血清)后于2-8℃ 3000轉(zhuǎn)/分離心15MIN,取上清即可立即檢測;或進(jìn)行分裝,并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣本應(yīng)再次離心,然后檢測。
3、血漿樣本(干冰運(yùn)輸)
可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃C3000轉(zhuǎn)/分離心15MIN,取上清即可立即檢測;或進(jìn)行分裝,并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣本應(yīng)再次離心,然后檢測。
4、細(xì)胞樣本貼壁細(xì)胞
將細(xì)胞用PBS沖洗2次后,用細(xì)胞刮將細(xì)胞小心刮下來,將培養(yǎng)液3000轉(zhuǎn)/分,離心10MIN。棄上清留細(xì)胞沉淀,干冰運(yùn)輸。懸浮細(xì)胞:將培養(yǎng)液3000轉(zhuǎn)/分,離心10MIN。棄上清留細(xì)胞沉淀,干冰運(yùn)輸。
5、細(xì)胞上清: 標(biāo)本于2-8℃,3000轉(zhuǎn)/分離心15MIN取上清,上清立即用于實(shí)驗(yàn)或分裝后于-20℃或-80℃保存。避免反復(fù)凍融。
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