一、模型概述

　　1. 設(shè)計腦膠質(zhì)瘤動物模型原則:

　?、倌[瘤須起源于腦膠質(zhì)細(xì)胞;

　?、谀[瘤細(xì)胞能在體外或體內(nèi)正常生長和增殖;

　?、勰[瘤生長狀況可評估;

　?、苣Ｐ湍[瘤應(yīng)具有與人腦膠質(zhì)瘤相似的生物學(xué)特征，如浸潤性生長、異常血管生成、血－腦屏障通透性的改變等;

　?、莺闪鍪笊嫫趹?yīng)盡可能長，以用于檢驗和治療;

　?、弈[瘤細(xì)胞對同源宿主的免疫排斥低;

　?、吣[瘤細(xì)胞無皮下或硬膜外腔轉(zhuǎn)移;

　　⑧模型對治療手段的反應(yīng)可模擬臨床工作中人腦膠質(zhì)瘤的治療過程。

　　2. 受體動物選擇

　?、?嚙齒類動物

　　建立腦膠質(zhì)瘤移植瘤動物模型最常用的受體動物為雄性大、小 鼠類等。

　　研究表明雌激素及孕激素某種程度上對腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生有抑制作用，因此應(yīng)使用雄鼠構(gòu)建動物模型。常用的大鼠有 SD 大鼠、Wistar大鼠、Fischer344大鼠等，小鼠有 BALB /C 小鼠、昆明小鼠、C57小鼠及裸鼠等。

　　② 其他動物

　　斑馬魚模型在癌癥研究方面取得了顯著的進展，這些研究的一個重要基礎(chǔ)是斑馬魚模型和人類腫瘤中的分子通路具有高度的相似性和保守性。

　　斑馬魚模型的一個嚴(yán)重缺陷是，腦膠質(zhì)瘤處于 32℃的環(huán)境中，可能會對新陳代謝和致癌分子通路的活性產(chǎn)生影響。

　　現(xiàn)階段，如豬、犬等，也被用作腦膠質(zhì)瘤實驗動物模型的受體動物。

　　3. 模型的構(gòu)建

　?、?種植位置選擇

　　異位移植瘤模型多通過在動物皮下注射腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液，然后用卡尺測量腫瘤體積變化以觀察腫瘤生長情況。由于接種位置與中樞神經(jīng)系統(tǒng)在微環(huán)境上存在明顯差異，且機體強烈的免疫排斥導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生自愈傾向，使模型穩(wěn)定性欠佳，限制了異位移植瘤模型的應(yīng)用。

　?、?原位移植瘤手術(shù)方法與要點

　?、俨捎眉羲槟[瘤組織塊，然后用針管將其植入到動物顱內(nèi)的方法，這種方法雖然操作簡單，但難以保證定位的精確性及操作的穩(wěn)定性，成功率低，且難以定量研究。

　?、诶昧Ⅲw定向技術(shù)將經(jīng)過培養(yǎng)的、標(biāo)準(zhǔn)定量的腫瘤細(xì)胞接種到鼠腦中。使用立體定向儀，成瘤率明顯提高。用此法可使腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞能定位、定量地注入目標(biāo)位置，防止針頭誤入側(cè)腦室，減少顱外生長，從而使構(gòu)建的模型更為可靠。

　　二、誘導(dǎo)模型

　　根據(jù)誘導(dǎo)劑的不同，腦膠質(zhì)瘤動物模型又主要分為化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)和病毒誘發(fā)型。

　　化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)的腦膠質(zhì)瘤動物模型

　　首見是利用甲基膽蒽制成丸劑植入小鼠腦內(nèi)而成功誘發(fā)的腦膠質(zhì)瘤。隨后,又出現(xiàn)了新的致瘤物質(zhì)，如烷化劑, 尤其是甲基亞硝基脲和乙基亞硝基脲在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有很高的腫瘤誘發(fā)率。

　　研究表明由乙基亞硝基脲誘發(fā)的Fisher大鼠腦膠質(zhì)瘤模型, 聯(lián)合影像學(xué)的應(yīng)用, 是實驗室模擬治療低級膠質(zhì)瘤的有效方法。

　　化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)的膠質(zhì)瘤模型病程與人類膠質(zhì)瘤較為相似, 可被用于膠質(zhì)瘤的移植試驗等, 但也存在誘發(fā)腫瘤的遺傳背景不清楚、種類不一、性質(zhì)不穩(wěn)定等缺點。

　　病毒誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的可能機制有兩個：

　　①是病毒通過將其基因組整合至宿主細(xì)胞基因組, 導(dǎo)致宿主腫瘤相關(guān)基因的激活或抑癌基因的失活。

　　②是有些病毒基因內(nèi)含有致癌基因, 其編碼的蛋白可促使宿主細(xì)胞發(fā)生癌變。

　　目前應(yīng)用于誘發(fā)腦膠質(zhì)瘤動物模型的病毒有 BKV、JCV 和 RSV等。

　　病毒誘發(fā)模型是用于研究膠質(zhì)瘤放/化療效果的較好模型；但由于該膠質(zhì)瘤模型動物表達(dá)某些病毒性腫瘤特異性抗原, 在研究膠質(zhì)瘤免疫療法時, 表現(xiàn)出很強的免疫原性, 因此，在實際應(yīng)用中并不常用。

　　三、移植模型

　　移植性動物模型是目前應(yīng)用最多的腫瘤模型, 也是膠質(zhì)瘤動物模型中使用最多的方法。

　　移植性腫瘤動物模型可分為異種移植和同種移植模型：

　　1. 異種移植模型

　　為了更好地模擬人腦膠質(zhì)瘤的特性，異種移植瘤模型常用原代人源腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞、腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞( glioma stem cell，GSC) 和腦膠質(zhì)瘤組織。常用的細(xì)胞系包括人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U87、U251、LN229、T98G、U373 等。

　　如人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U251 皮下或顱內(nèi)注射的裸鼠模型, 可模擬人類膠質(zhì)瘤的典型性特征, 在組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)方面與人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤極為相似; 人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U87 顱內(nèi)注射的裸鼠模型雖然與人類膠質(zhì)瘤不太相似, 但卻是用于研究抗腫瘤血管生成及膠質(zhì)瘤高復(fù)發(fā)率的良好模型。

　　2. 同種移植模型

　　同種移植動物模型的特點是腫瘤組織或細(xì)胞移植發(fā)生在同種或同系動物之間。同種移植瘤模型常用的細(xì)胞系包括大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 C6、9L和小鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261、G422等

　　小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 GL261顱內(nèi)注射正常小鼠模型; 大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 C6 接種于 Long–Evans大鼠模型; 大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 9L 腦紋狀體注射Wistar大鼠模型。

　　這類模型具有以下性質(zhì):

　　①在顱內(nèi)形成的移植瘤能較好地模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的微環(huán)境;

　?、谏L在腦內(nèi)的移植瘤能夠在種植位置局部以浸潤方式生長，與人腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為相對一致。過去原位移植瘤模型存在操作復(fù)雜、難以觀察腫瘤生長情況等缺陷，但隨著立體定向注射技術(shù)和影像診斷技術(shù)的進步，原位移植瘤模型有了更加廣泛的應(yīng)用空間。

　　四、轉(zhuǎn)基因模型

　　小鼠是最主要的轉(zhuǎn)基因模式動物, 被廣泛的應(yīng)用于生物科學(xué)和醫(yī)藥研究中。目前采用的方法主要有兩大類：

　?。?）傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠類型；

　　（2）病毒載體介導(dǎo)類型。

　　很多人類腫瘤的發(fā)生通常伴隨著癌基因的激活和抑癌基因的突變或缺失, 膠質(zhì)瘤的發(fā)生也不例外。

　　1. 傳統(tǒng)的基因工程小鼠腫瘤模型

　　在受精卵和胚胎干細(xì)胞水平進行基因?qū)牖蚯贸梢越鹘y(tǒng)基因工程小鼠模型。但是，成人腦膠質(zhì)瘤主要是后天在環(huán)境因素的影響下發(fā)病，而傳統(tǒng)的基因工程小鼠模型是在其胚胎發(fā)育期人為更改腫瘤發(fā)生基因或腫瘤抑制基因的表達(dá)水平，其腫瘤的發(fā)生時間比人類腦膠質(zhì)瘤的好發(fā)年齡早。

　　此外，由于基因敲除小鼠的所有體細(xì)胞基因組上都存在靶基因的缺失或突變，有些基因敲除后動物難以成活，無法進行后續(xù)研究。因此，目前已基本不采用此模型。

　　2. 病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型

　　根據(jù)使用載體的不同又可分為腺病毒介導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)和慢病毒介導(dǎo)膠質(zhì)瘤模型。

　　三種載體各有其優(yōu)缺點：

　　腺病毒載體具有高效傳遞和表達(dá)基因的能力, 但腺病毒自身具有的非特異致瘤性限制了其應(yīng)用;

　　逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組能穩(wěn)定地整合至宿主基因組中, 但其宿主范圍較窄, 只能感染分裂細(xì)胞;

　　慢病毒載體是目前應(yīng)用前景較好的轉(zhuǎn)基因載體, 該載體不僅能將外源基因有效地整合到靶細(xì)胞基因組內(nèi), 而且可以感染各種非分裂細(xì)胞。

　五、模型評價

　　1、動物行為學(xué)評價

　　觀察動物表現(xiàn)既往采用觀察癥狀、體征的方法對動物模型的腫瘤生長情況進行評估，如進食情況、體重、精神狀態(tài)以及壓迫癥狀( 顱內(nèi)壓增高表現(xiàn)、偏癱) 等。

　　2、組織學(xué)檢查

　　瘤體形態(tài)欠規(guī)則，無包膜，向周圍浸潤生長，切面色白，呈魚肉狀。

　　3、病理染色

　　HE染色后鏡下觀察，可見腫瘤區(qū)較正常腦組織染色深，有較明確的邊界。腫瘤細(xì)胞豐富、密集，常排列呈束狀及小團塊狀，細(xì)胞分化差，胞核大、圓、深染，核分裂象多見。

　　腫塊內(nèi)部血管豐富，常見柵欄狀壞死區(qū)，瘤周組織可有水腫。Ki-67染色結(jié)果可反映腫瘤細(xì)胞的增殖能力。

　　4、小動物活體成像檢查

　　活體成像發(fā)光技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤體內(nèi)實驗。

　　該技術(shù)是讓腫瘤細(xì)胞帶上熒光素酶( Luciferase)或綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)簽，然后用小動物活體成像儀檢測腫瘤的生物發(fā)光或熒光，以直觀可視地、動態(tài)地觀察腫瘤生長，檢測腫瘤生長情況以評估腫瘤大小。

　　5、影像學(xué)檢查

　　磁共振成像( MＲI) 技術(shù)的應(yīng)用為動物成瘤過程的檢測提供了新的途徑。

　　它作為一種無創(chuàng)性的影像學(xué)檢測方法，可以在不處死動物的情況下對腫瘤的生長情況進行動態(tài)的、多方位的觀察，便于在適當(dāng)?shù)臅r間進行藥效學(xué)研究。