條件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重組系統(tǒng)

條件性基因 敲除主要是通過Cre／10xP或者Ftp／FRT重組系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的。這兩個(gè)系統(tǒng)都是位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)，已發(fā)展成為在體內(nèi)、外進(jìn)行遺傳操作的有力工具。這兩個(gè)系統(tǒng)的應(yīng)用，可以使靶基因的表達(dá)或缺失發(fā)生在試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官。此外，若與控制Cre或Flp表達(dá)的其他誘導(dǎo)系統(tǒng)相結(jié)合，還可以對(duì)某一基因同時(shí)實(shí)現(xiàn)時(shí)空兩方面的調(diào)控。

1．Cre／loxP系統(tǒng)的原理

Cre／loxP系統(tǒng)來源于F1噬菌體，可以介導(dǎo)位點(diǎn)特異的DNA重組。該系統(tǒng)含有兩種成分：①一段長(zhǎng)34bp的DNA序列，含有兩個(gè)13 bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8 bp的核心序列。這段34bp序列是重組酶識(shí)別的位點(diǎn)，被稱為loxP位點(diǎn)(10cus of X―over in P1)。②Cre重組酶(cyclizationrecombination)，它是一種由343個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，可以引發(fā)loxP位點(diǎn)的DNA重組。任何序列的DNA，當(dāng)其位于兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的時(shí)候，在Cre重組酶的作用下要么被缺失(兩個(gè)loxP位點(diǎn)的方向相同)，要么方向發(fā)生倒轉(zhuǎn)(兩loxP位點(diǎn)的方向相反)，如圖所示。

Cre／loxP系統(tǒng)的作用機(jī)制

2．Cre／loxP系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)

Cre／10xP系統(tǒng)之所以在基因敲除中獲得了非常廣泛的應(yīng)用，是由該系統(tǒng)的諸多優(yōu)點(diǎn)決定的：①Cre重組酶與具有l(wèi)oxP位點(diǎn)的DNA片斷形成復(fù)合物后，可以提供足夠的能量引發(fā)之后的DNA重組過程，因此該系統(tǒng)不需要細(xì)胞或者生物體提供其他的輔助因子；②loxP位點(diǎn)是一段較短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，因此可以在生物體不同的組織、不同的生理?xiàng)l件下發(fā)揮作用；④Cre重組酶的編碼基因可以置于任何一種啟動(dòng)子的調(diào)控之下，從而使這種重組酶在生物體不同的細(xì)胞、組織、器官，以及不同的發(fā)育階段或不同的生理?xiàng)l件下產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮作用，這一點(diǎn)也是該系統(tǒng)在應(yīng)用過程中最為重要的一點(diǎn)。

3．Cre／loxP系統(tǒng)的工作流程

利用Cre／loxP系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)某特定基因在特定條件下的敲除，需要兩只轉(zhuǎn)基因小鼠。第一只小鼠一般采用胚胎干細(xì)胞技術(shù)獲得，首先在體外構(gòu)建一個(gè)在目的基因兩端分別含有一個(gè)loxP位點(diǎn)的基因序列，之后將體外構(gòu)建好的這段基因序列轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞內(nèi)，使其通過同源重組替代細(xì)胞基因組內(nèi)原來的基因序列。經(jīng)過這樣處理的胚胎干細(xì)胞被重新植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育成為一個(gè)完整的胚胎，最終成為一只轉(zhuǎn)基因小鼠。在這只轉(zhuǎn)基因小鼠中，loxP位點(diǎn)被引入到相應(yīng)基因的內(nèi)含子內(nèi)，理論上不會(huì)對(duì)相應(yīng)基因的功能產(chǎn)生影響，因此一般情況下，該小鼠的表型是正常的。第二只轉(zhuǎn)基因小鼠一般采用卵母細(xì)胞注射或者胚胎干細(xì)胞技術(shù)獲得，在這只小鼠中，Cre重組酶被置于某特定基因啟動(dòng)子的調(diào)控之下，可以使其在某特定的條件下表達(dá)。最后，讓這兩只小鼠進(jìn)行交配，產(chǎn)生的同時(shí)含有上述兩種基因型的子代小鼠就會(huì)在某一特定類型的細(xì)胞中缺失某一特定的基因。

很明顯，在何種組織細(xì)胞或器官中敲除某一特定的基因取決于所選擇的啟動(dòng)子。只要選擇合適的啟動(dòng)子調(diào)控Cre重組酶的表達(dá)，使其在生物體特定的部位、特定的條件下產(chǎn)生，就可以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)條件下某一特定基因的敲除。迄今為止，研究者們已經(jīng)成功地利用多個(gè)不同的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了在不同條件下的基因敲除，這些啟動(dòng)子可以是細(xì)胞類型特異的，如lck啟動(dòng)子(胸腺細(xì)胞)、alphaA晶狀體球蛋白啟動(dòng)子(眼晶狀體)、鈣調(diào)素依賴性激酶Ⅱ啟動(dòng)子(海馬和大腦新皮質(zhì))、乳清酸性蛋白啟動(dòng)子(乳腺)、aP2啟動(dòng)子(脂肪組織)、AQP2啟動(dòng)子(腎臟集合管)和肌漿蛋白啟動(dòng)子(骨骼肌)等。啟動(dòng)子也可以受某些外源性化學(xué)物質(zhì)的調(diào)控，外源性調(diào)控的基因敲除可以避免在胚胎發(fā)育早期由于基因功能的異常所產(chǎn)生的副作用，如干擾素反應(yīng)Mxl啟動(dòng)子、他莫西酚依賴的雌激素突變體啟動(dòng)子和四環(huán)素調(diào)節(jié)系統(tǒng)等