分子實(shí)驗(yàn)
熒光定量PCR（QPCR）
一、實(shí)驗(yàn)概念
RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄pcr,其原理是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，利用Oligo(dt)或隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA模板，進(jìn)一步通過PCR反應(yīng)獲得目的基因產(chǎn)物或檢測(cè)其表達(dá)水平。與其他技術(shù)相比，RT-PCR技術(shù)更加靈敏易于操作，在細(xì)胞/組織基因表達(dá)水平的半定量檢測(cè)，特定基因cDNA克隆及RNA病毒檢測(cè)等分子生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
二、實(shí)驗(yàn)流程
樣本接收→引物合成→提取總RNA→RNA濃度測(cè)定→逆轉(zhuǎn)錄成cdna→熒光定量PCR→數(shù)據(jù)分析
三、注意事項(xiàng)
1.普通PCR及realtime PCR樣本 注意事項(xiàng) | ||||
樣本形式 | 處理方式 | 保存 | 運(yùn)輸 | 可檢測(cè)指標(biāo)數(shù) |
新鮮組織 | 1、 0.1g新鮮組織(至少) | 液氮或-80℃ | 干冰 | 3-5個(gè) |
| 2、 加入1ml的Trizol（可選） |
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細(xì)胞 | 1、 培養(yǎng)基吸出棄掉，用PBS洗滌兩次后，吸棄PBS。 | 液氮或-80℃ | 干冰 | 2-3個(gè) |
| 2、 每1*10^6個(gè)細(xì)胞加1ml TRIzol，細(xì)胞刮板掛或吹打使細(xì)胞脫落，吹至拉絲狀，收集之后凍存?zhèn)溆谩?/p> |
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全血 | 1、大于等于2ml全血加入EDTA或肝素抗凝。 | 4℃ | 冰袋 | 3-5個(gè) |
| 2、4h內(nèi)進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離 | 液氮或-80℃ | 干冰 | 詢問 |
體液 | 1. 12000rpm/min離心10-20min，取沉淀 | 液氮或-80℃ | 干冰 | 詢問 |
1.組織在1-2min內(nèi)完成取材，速凍，，并立即放入-80℃或液氮中保存。 | ||||
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
擴(kuò)增完畢后，進(jìn)入結(jié)果分析界面，看CT值、起始拷貝數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差等，如果是SYBR做的話，再看下溶解曲線。以β-actin為內(nèi)參照基因，與對(duì)照組相比，得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值（RQ值），將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。